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   elisa試劑盒操作步驟包括樣本的采集和保存、試劑和樣本的平衡、加樣、溫育、洗滌、顯色、比色、結(jié)果判定和結(jié)果報(bào)告。環(huán)節(jié)眾多，任一環(huán)節(jié)操作不當(dāng)，皆可影響測(cè)定結(jié)果。因此，必須重視各環(huán)節(jié)操作，掌握控制要點(diǎn)，方能保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1  樣本的采集和保存  

 作為激素和治療藥物測(cè)定的樣本應(yīng)考慮采集時(shí)間及體位等因素影響,可的松和促激素清晨會(huì)有一峰值出現(xiàn)；生長(zhǎng)激素、促黃體激素、促卵泡激素均以陣發(fā)性方式排放；從臥位變?yōu)檎疚粫r(shí)，腎素活性將明顯增高；藥物濃度監(jiān)測(cè)應(yīng)根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)選擇合適時(shí)間采集樣本。

外源性干擾因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，溶血、脂血、細(xì)菌污染、血液標(biāo)本收縮不充分、存貯過(guò)久、反復(fù)融凍等。盡量使用玻璃試管抽血，慎用塑料試管盛血，因聚乙烯易吸附抗原和抗體，影響檢測(cè)結(jié)果。

2日內(nèi)測(cè)定血液樣本，，置2℃—8℃冰箱保存；2日至7日內(nèi)測(cè)定，置2℃—8℃冰箱保存；7日以上測(cè)定，置-20℃以下冰箱保存。

2  試劑和樣本的平衡   

試劑和樣本在測(cè)定前應(yīng)先放置室溫（20℃—25℃）平衡20分鐘以上，以保證后續(xù)操作步驟中抗原抗體足夠反應(yīng)溫度。

3  加樣本及試劑   

應(yīng)正確使用移液器和試劑滴瓶。移液器應(yīng)定期校準(zhǔn)和維護(hù)，加樣本時(shí)，應(yīng)加在微孔下1/3處，不可擦劃底部、沖起泡、加到微孔上緣或?yàn)R出。滴加試劑（包括抗原、酶結(jié)合物及顯色劑）時(shí)，應(yīng)搖勻試劑，先棄去瓶口1—2滴，然后垂直、均勻加入微孔。

4  溫育  

 溫育是ELISA操作中的關(guān)鍵步驟。國(guó)產(chǎn)試劑通常采用37℃30分鐘和37℃60分鐘兩種方式。為保證溫度均一，抗原抗體反應(yīng)充分，宜采用水浴方式加熱。如用孵箱，可內(nèi)置一方盤(pán)，底襯紗布，加入適量水，微孔板放入其中溫育。

5  洗滌  

 ELISA為異相固態(tài)方式檢測(cè)，所以分離結(jié)合和游離酶結(jié)合物是一個(gè)重要環(huán)節(jié)，洗滌即是達(dá)到這樣一個(gè)目的。洗板質(zhì)量直接影響檢測(cè)結(jié)果，所以需重視洗板質(zhì)量?，F(xiàn)在新推出的洗板機(jī)大多增設(shè)有兩點(diǎn)吸液、底部沖洗和振蕩等功能，可以充分保證洗板質(zhì)量。手工洗板時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作，洗滌不足和洗滌過(guò)度都將影響檢測(cè)結(jié)果。

6  顯色  

 ELISA顯色常用TMB和H2O2作為顯色劑，顯色時(shí)間37℃15—20分鐘，顯色過(guò)程可不避光。使用前應(yīng)檢查顯色劑是否變質(zhì)，嚴(yán)格控制顯色時(shí)間。顯色劑質(zhì)量檢查，在玻片、試管或eppendorf管中滴入顯色劑A和B各一滴，若不變色，則質(zhì)量可靠。繼續(xù)滴入一滴酶結(jié)合物，搖勻后幾分鐘內(nèi)溶液出現(xiàn)藍(lán)色，既可檢查顯色劑質(zhì)量，又可檢查酶結(jié)合物質(zhì)量。

7  比色   

加終止液終止顯色反應(yīng)后，通常要求30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀完成比色測(cè)定。采用主波長(zhǎng)450nm測(cè)定，可有效避免微孔上的劃痕、指印及其它附著物對(duì)光的干擾。另外，加終止液后，應(yīng)盡快比色，因?yàn)槌噬畹奈⒖滓壮霈F(xiàn)沉淀致吸光度下降明顯。

8        結(jié)果判斷和結(jié)果報(bào)告   

判斷結(jié)果時(shí)，要正確按照試劑盒要求設(shè)置計(jì)算參數(shù)，內(nèi)外對(duì)照值均應(yīng)在控，才能判定測(cè)定結(jié)果有效。對(duì)于少見(jiàn)模式和臨界值附近結(jié)果應(yīng)堅(jiān)持復(fù)核