RNA的提取原理及方法
更新時間：2019-03-29 點擊次數(shù)：11372次細胞中的 RNA 可以分為信使 RNA、轉運 RNA 和核糖體 RNA 三大類，不同組織總 RNA 提取的實質就是將細胞裂解，釋放出 RNA，并通過不同方式去除蛋白，DNA 等雜質，終獲得高純度 RNA 產物的過程。
RNA 提取流程
1.樣品處理
從各種不同來源樣品（如細菌、酵母、血液、動物組織、植物組織和培養(yǎng)細胞）,或同一來源樣品的不同組織（如植物幼嫩葉片、成熟根、莖等）中提取高質量的 RNA，因細胞結構及所含的成分不同，樣品預處理的方式也各有差異。
樣品的要求
使用新鮮的樣品或取樣后立即在低溫（-20℃或-70℃）冷凍保存的樣品，避免反復凍融，因為這會導致提取的 RNA 降解和提取量下降。
樣品預處理方式
植物材料-液氮研磨
動物材料-勻漿、液氮研磨
細菌-溶菌酶破壁
酵母-液氮研磨、玻璃珠處理、混合酶破壁
2.細胞裂解
異硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）
這是一種傳統(tǒng)的 RNA 提取方法，適用于大部分動植物材料，但對于次生代謝產物較多的植物材料提取 RNA 效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復合體解離，并將 RNA 釋放到溶液中，采用酸性酚-氯fang混合液抽提，低 PH 值的酚將使 RNA 進入水相，而蛋白質和 DNA 仍留在有機相，從而可以完成 RNA 的提取工作。
該法應用非常廣泛，適用于包括動物組織、微生物、培養(yǎng)細胞等在內的各類動物性材料，同時還適用于次生代謝物較少的植物性材料，如幼苗、幼葉等。該法主要應用在動物組織和培養(yǎng)細胞的 RNA 提取中。
胍鹽/β-巰基乙醇法
適用于各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料。
在這種方法中，胍鹽使細胞充分裂解，β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實驗全程中可以抑制 RNaseA 的活性，保護 RNA 不被降解。有些植物材料多糖多酚含量較高，如植物果實，番茄的葉子等，有些植物木質化程度較高，如根莖等組織。針對這類材料本公司推出了一種全新的植物總 RNA 提取試劑，該試劑特別適合于從富含多糖、多酚、淀粉的材料中提取純度高、完整性好的總 RNA，有關的具體步驟將在分論中詳細介紹，實驗者可根據(jù)自己的需要進行選擇。
3.RNA 純化及獲得
純化要求
RNA 樣品中不應存在對酶（如逆轉錄酶）有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染。排除 DNA 分子的污染。
純化方法及沉淀
方法一：有機溶劑抽提法
氯fang抽提
在使用 RNA 提取試劑進行 RNA 提取時，常使用氯fang進行抽提，以去除蔗糖、蛋白等雜質，并促進水相與有機相的分離，從而達到純化RNA 的方法。
沉淀
氯fang抽提 RNA 后，一般采用了異丙醇或乙醇來沉淀水相 RNA。加入 0.6 倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇，室溫沉淀 20-30 分鐘，高速離心，可獲得 RNA 沉淀。
洗滌沉淀
加入無 RNase 的 75%乙醇，將 RNA 沉淀振蕩懸浮，使 RNA 沉淀中的鹽離子被充分溶解。然后再離心 10-30 分鐘。再次沉淀 RNA。離心后，小心倒掉上清（注意不要倒出 RNA 沉淀），隨后快速離心 1-2 秒，將殘留在管壁上的乙醇試劑到管底后，用小槍頭吸凈，超靜臺中風干 1-2 分鐘（注意不要晾得太干，否則 RNA 沉淀不易溶解）。
溶解沉淀
加入適量 RNase-free ddH2O 溶解 RNA 沉淀。
方法二：硅基質吸附法
隨著實驗方法的改進，現(xiàn)已發(fā)展出一種采用吸附材料純化核酸的方法。目前較常見的有：硅基質吸附材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。硅基質吸附材料具有可特異吸附核酸，使用方便、快捷、不使用有毒溶劑如苯酚、氯fang等優(yōu)點。
一些特殊組織的 RNA 提取
纖維組織
心臟/骨骼肌等纖維組織提取 RNA 的關鍵在于*破碎組織。這些組織細胞密度低，單位重量的組織中 RNA 含量較低，建議增加起始量。
此外，一定要在液氮中將組織*磨碎。
蛋白/脂肪含量較高的組織
腦或植物脂肪含量高，酚/氯fang抽提后，上清含白色絮狀物。必須用氯fang再次對上清進行抽提。
核酸/RNase 含量高的組織
脾、胸腺等組織的核酸和 RNase 含量很高，在液氮中研磨，再快速勻漿，能有效滅活 RNase。如加入裂解液后變得粘稠，酚/氯fang抽提不能有效分層，則加入更多裂解液可以解決此問題。多次酚/氯fang抽提可以去除更多殘留的 DNA。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成，表明可能有 DNA 污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯fang再次抽提或者用 Dnase1 消化，去除 DNA 污染。
植物組織和真菌組織
植物組織和真菌組織比動物組織更為復雜，一般選擇在液氮條件下對樣品進行研磨，以避免內源 RNase 降解 RNA。如果 RNA 降解問題不能解決，大多數(shù)情況下是樣品中含有的雜質所致。許多植物和真菌中的內含雜質和多糖、多酚等都會殘留，因為這些雜質分子與 RNA 有一些相似性，可與 RNA 同時沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的提取中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑來去除多糖多酚等雜質的干擾和污染。
RNA 評價與鑒定
提取得到 RNA 溶液后，我們需要對 RNA 進行相關的質量檢測，以確定它是否符合后續(xù)實驗的要求。RNA 用于不同的后續(xù)實驗，對其質量要求不盡相同。cDNA 文庫構建要求 RNA 完整且無酶等抑制物殘留；Northern blot 實驗對 RNA 完整性要求較高，對酶反應抑制物殘留要求較低；RT-PCR 實驗對RNA 完整性要求不太高，但對酶反應抑制物殘留要求嚴格。因此在進行不同的實驗時應選擇不同的方法純化RNA，以達到jia的實驗效果。
RNA 得率檢測—分光光度計法
RNA 得率有很強的組織特異性，不同組織 RNA 的豐度和 RNA 提取的易難程度共同決定了該種組織的 RNA 得率。一般來說，可通過分光光度計測定 RNA 溶液在 260nm 處的吸光值來計算 RNA 的含量。RNA 溶液在 260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液渾濁度、雜質濃度和蛋白等有機物的吸收值。用標準樣品測得在波長260nm 處，1ug/mlRNA 鈉吸光度0.025（光程為1cm），即OD260=1時，樣品中 RNA 濃度為 40ug/ml。通常分光光度計 OD260 的讀數(shù)要介于 0.15-1.0 之間才是可靠的。因此 RNA 提取結束后，要根據(jù)大概產量稀釋到適當濃度范圍，再用分光光度計檢測。
按下面的共識計算總 RNA 濃度：
- RNA 濃度（ug/ml）=OD260×稀釋倍數(shù)×40ug/ml
RNA 純度檢測---分光光度計法
通過 OD260/280 來檢測 RNA 純度，OD260/230 作為參考值。
OD260/280 在 1.9-2.1 之間，可以認為 RNA 的純度較好；
OD260/280 值小于 1.8，則表明蛋白雜質較多；
OD260/280 值大于 2.2，則表明 RNA 已經(jīng)降解；
OD260/230 值小于 2.0，則表明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙醇法殘留。
注意：如果用 TE 溶解或洗脫 RNA，會使 OD260/280 值偏大。
