測定意義： LOX廣泛存在于植物組織中，催化不飽和脂肪酸氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜脂過氧化。在植物的生長發(fā)育、成熟衰老及逆境脅迫過程中具有重要作用。 測定原理： LOX催化亞油酸氧化，氧化產(chǎn)物在234nm處有特征吸收峰；測定234nm吸光度增加速率，來計算LOX活性。 自備儀器和用品： 研缽、冰、臺式離心機(jī)、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。 試劑組成和配制： 試劑一：液體×1瓶，4℃保存。 試劑二：液體×1瓶，4℃保存。 試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2mL試劑二，充分溶解。 粗酶液提取： 稱取約0.1g樣品，加試劑一1mL，冰上充分研磨，16000g 4℃離心20min，取上清液待測。 測定： 1. 分光光度計預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長到234 nm，蒸餾水調(diào)零。 2. 試劑二在25℃水浴中預(yù)熱30 min以上。 3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸餾水、160μL試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于234nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A1和A2。 4. 測定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于234nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A3和A4。 LOX活性計算： a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下 （1）按蛋白濃度計算 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1U。 LOX (U/mg prot) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V反總÷(Cpr×V樣)÷T×1000= 10 000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷Cpr （2）按樣本鮮重計算 活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1U。 LOX (U/g 鮮重) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T×1000= 10 000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷W Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，需另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4L；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣總：上清液總體積，1mL；T：反應(yīng)時間。 b.使用96孔板測定的計算公式如下 （1）按蛋白濃度計算 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1U。 LOX (U/mg prot) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V反總÷(Cpr×V樣)÷T×1000= 10 000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷Cpr （2）按樣本鮮重計算 活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘催化吸光值變化0.001個單位為1U。 LOX (U/g 鮮重) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T×1000= 10 000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷W Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，需另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4L；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣總：上清液總體積，1mL；T：反應(yīng)時間。 注意事項： 1．試劑三易自發(fā)氧化，從而導(dǎo)致空白管測定值偏高，必須臨用前配制。 2．樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日完成酶活性測定。 |
