測定意義： PDC主要存在于酵母中，是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶之一，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。 測定原理： PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶（ADH）來進一步催化 NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+；NADH在340 nm有吸收峰，而NAD+沒有；通過測定340 nm光吸收下降速率，來計算PDC活性。 自備儀器和用品： 研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。 試劑組成和配制： 試劑一：液體×1瓶，4℃保存。 試劑二：液體×1瓶，4℃保存。 試劑三：液體×1瓶，4℃保存。 試劑四：液體×1瓶，﹣20℃保存。 混合試劑：臨用前配制，小心把試劑四轉(zhuǎn)移到試劑三中，充分溶解。 試劑六：液體×1管，4℃保存。 粗酶液提取： 稱取約0.1g樣品，加試劑一1 mL，冰上充分研磨，16000g 4℃離心20min，取上清液，待測。 PDC測定操作： 1. 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。 2. 試劑二置于25℃水浴中預(yù)熱30min以上。 3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸餾水、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A1和A2。 4. 測定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A3和A4。 PDC活性計算： a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下 （1）按蛋白濃度計算 活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1U。 PDC (U/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷(ε×d)×V總×106}÷(Cpr×V樣) ÷T =1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr （2）按樣本鮮重計算 活性單位定義：25℃中，每克樣品每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1U。 PDC (U/g 鮮重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷(ε×d)×V總×106}÷(V樣÷V樣總×W) ÷T =1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10-4 L，V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒；W ：樣品質(zhì)量； T：反應(yīng)時間，1 min。 b.使用96孔板測定的計算公式如下 （1）按蛋白濃度計算 活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1U。 PDC (U/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷(ε×d)×V總×106}÷(Cpr×V樣) ÷T =3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr （2）按樣本鮮重計算 活性單位定義：25℃中，每克樣品每分鐘催化1μmol NADH 氧化為1U。 PDC (U/g 鮮重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷(ε×d)×V總×106}÷(V樣÷V樣總×W) ÷T =3.22×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10-4 L，V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒；W ：樣品質(zhì)量； T：反應(yīng)時間，1 min。 |
