免疫組化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作的要領(lǐng)是什么
更新時(shí)間:2015-07-06 點(diǎn)擊次數(shù):1233次我們?cè)谧雒庖呓M化實(shí)驗(yàn)的時(shí)候,總是會(huì)遇到這樣那樣的問(wèn)題,上海信帆生物科技有限公司告訴大家免疫組化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作的要點(diǎn)具體是什么?
1.固定:用 4% 的多聚甲醛固定液。對(duì)于冰凍切片,甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好;但對(duì)于不同的組織和抗原,可選用不同的固定液。 有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而的固定液,請(qǐng)于購(gòu)置前注意說(shuō)明書。
Bouin S 固定液:飽和苦味酸 750ml ,甲醛 250ml ,冰醋酸 50ml ,其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng),固定較好,結(jié)構(gòu)完整,但因偏酸,對(duì)抗原有一定損害,且組織收縮明顯,不適于組織標(biāo)本的保存。
PLP 液:即高碘酸鈉 - 賴氨酸 - 多聚甲醛,適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織,對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。
2 .組織脫水,透明:時(shí)間不能太長(zhǎng),否則在切片時(shí)容易碎片,切不完整。
3 .切片時(shí)展片:有些組織在切片后難以在水中展開,這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?nbsp;
4 .烤片: 60℃ 30 分鐘或 37℃ 過(guò)夜,溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng),抗原容易丟失。
5 .蠟塊及切片的保存:在 4℃ 保存
6 .脫片問(wèn)題: Poly-L-Lysine( 多聚賴氨酸 ) 為目前免疫組化染色工作中zui常用的一種防脫片劑, 6ml 的多聚賴氨酸溶液可按 1:10 稀釋成 60ml 的工作液,適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行,可用雙重處理( APES 和 Poly-L-Lysine )的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下,可用如下方法:切片在脫蠟前,放在 APES 1 : 50 丙酮溶液中浸泡 3 分鐘,晾干,即可進(jìn)行下一步。
7 .滅活內(nèi)源性酶: HRP 系統(tǒng): 3% 雙氧水滅活; AP 系統(tǒng): 3%HAc 滅活。
8 .暴露抗原:對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí),必須采用高溫加熱抗原修復(fù),這將有助于暴露抗原決定簇,從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度 ( 不同抗體的*修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說(shuō)明書 ) 。對(duì)于不同的組織,不同的抗原,不同的抗體,所采用的方法應(yīng)不一樣,可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。
9 .封閉:在山羊血清封閉,非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí),可延長(zhǎng)封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉
10 .抗體稀釋:應(yīng)遵循 “ 現(xiàn)用現(xiàn)配 " 的原則,對(duì)于 PBS 稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。
11 .背景高:在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下,如果背景依舊高,可采用含 1‰ Tween20 的 PBS 洗,特別是在顯色之前要多洗。
12 .返藍(lán):在蘇木素復(fù)染后,可用堿性緩沖液(如 PBS )或 Na2HPO4 的飽和溶液返藍(lán)。
13 .顯色:一定要在顯微鏡下觀察,注意控制背景。