real-time PCR實驗檢測
更新時間：2017-11-16 點擊次數(shù)：1185次
real-time PCR實驗檢測
產(chǎn)品特點：
Real-Time PCR 技術(shù)，又稱實時定量熒光PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行總量分析或通過Ct值對模板進(jìn)行相對定量。
熒光定量PCR實驗步驟：
1、總RNA抽提（槍頭和離心管均經(jīng)過濕熱滅菌，無RNA酶）
1）取勻漿器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上預(yù)冷。
2）取100mg組織，加入到勻漿器中。
3）充分研磨直至無可見組織塊。
4）13000g離心10min取上清。
5）加入250 μl，顛倒離心管15s，充分混勻，靜置3min。
6）4℃下13000g離心8min。
7）將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。
8）-20℃放置15min。
9）4℃下13000g離心10min，管底的白色沉淀即為RNA。
10）吸除液體，加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。
11）4℃下13000g離心5min。
12）將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺上吹3min。
13）加入20μl無RNA酶的水溶解RNA。
14）55℃孵育5min。
real-time PCR實驗檢測
定量PCR：
1）取0.2ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。
2× qPCR Mix 12.5μl
7.5μM基因引物 2.0μl
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μl
ddH2O 8.0μl
2）取0.2ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。
2×qPCR Mix 12.5μl
7.5μM內(nèi)參引物 2.0μl
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μl
ddH2O 8.0μl
3）PCR擴(kuò)增
預(yù)變性 95℃，10min
循環(huán)（40次） 95℃，15s→60℃，60s
溶解曲線 75℃→95℃，每20s升溫1℃
注意事項：
1、長度：15—30bp。
2、G十c含量：應(yīng)在40%一60%之間。
3、堿基分布的隨機(jī)性
4、引物自身：不要含有自身互補(bǔ)序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。
5、引物之間：兩個引物之間不應(yīng)有多于4個的互補(bǔ)或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。
6、上下游引物的互補(bǔ)性：一個引物的3‘末端序列不允許結(jié)合到另一個引物的任何位點上。
7、3’末端：如果可能的話，每個引物的3‘末端堿基應(yīng)為G或C。
8、設(shè)計RT-PCR的引物時，上下游引物要跨內(nèi)含子，以消除基因組DNA的干擾。
9、引物設(shè)計好后再NCBI上進(jìn)行序列比對，檢查是否可能有錯配產(chǎn)物擴(kuò)增。
10、引物設(shè)計要注意種屬。
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