Western Blot技術(shù)服務(wù)，常規(guī)指標(biāo)贈(zèng)送一抗二抗
更新時(shí)間：2018-08-07 點(diǎn)擊次數(shù)：1005次Western Blot技術(shù)服務(wù)，常規(guī)指標(biāo)贈(zèng)送一抗二抗。
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操作步驟
試劑準(zhǔn)備
1、SDS-PAGE試劑：見電泳實(shí)驗(yàn)。
2、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml；10%SDS 6.0ml；β-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。
3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。
5、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。
6、顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H202 1.0μl。
樣品制備
1、單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?br />（1）倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
（2）每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）
（4）每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。
（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行）。
（6）于4℃下12000rpm離心5min（提前開離心機(jī)預(yù)冷）。
（7）將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5ml的離心管中放于－20℃保存。
2、組織中總蛋白的提?。?br />（1）將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
（2）加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。
（3）幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。
（4）裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。
3、加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?br />由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?br />（1）將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。
（2）棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。
（3）用槍洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。
（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。
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