信帆生物帶您了解更新更全的明膠酶譜分析試劑盒檢測原理
更新時間：2019-06-12 點擊次數(shù)：1260次信帆生物帶您了解更新更全的明膠酶譜分析試劑盒檢測原理
隨著科技的進(jìn)步，明膠酶譜法實驗被越來越多的科學(xué)研究者用于各類實驗，那么明膠酶譜的原理是什么呢？讓我們一起來揭秘吧！
首先讓我們來了解一下酶譜法的原理。基本過程是先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明膠）電泳分離，然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復(fù)活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色，在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。
上海信帆生物供應(yīng)明膠酶譜分析試劑盒，也叫明膠酶譜電泳試劑盒，該試劑盒的原理又是怎樣的呢？
本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達(dá)1 nM，高于ELISA方法，其基本原理1和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液，可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測靈敏度~1nM。試劑盒可進(jìn)行50次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測，如果小膠加樣孔為10~15個，則總計可檢測500~750個樣品。
凝膠制備
1.玻璃板對齊后放入夾中，垂直卡緊，加滿水檢漏。
2.配10%分離膠，APS和TEMED作用為促凝，后灌膠前加。若板不漏水，則將水倒出，并用吸水紙洗凈后灌膠，灌至大約3/4處，上面加滿水壓平。
3.配濃縮膠，同樣地，APS和TEMED后加，分離膠灌入約30min后觀察小燒杯中剩余分離膠是否已凝，同時仔細(xì)觀察可見玻板水和膠間有一條折線，說明膠已凝固。
4.將上面的水倒去，吸水紙洗凈，灌入濃縮膠，灌滿，注意一定不要有氣泡，然后將梳子插入，注意保持水平，約30min后凝固可用。
5.拔梳子在電泳緩沖液中拔，加樣孔用小針筒沖洗干凈再上樣，注意上樣時勿使樣品逸至鄰孔，樣品混勻時要輕，不要產(chǎn)生氣泡，否則加樣時易導(dǎo)致逸出而使結(jié)果不準(zhǔn)確。
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