免疫熒光雙標(biāo)三色（切片）

服務(wù)介紹：

免疫熒光雙重標(biāo)記即利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，在同一張切片上兩個抗原進(jìn)行同時標(biāo)記，從而實現(xiàn)定位，定性，半定量的分析。

實驗流程：

　　異源雙標(biāo)：

1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環(huán)保型脫蠟液10min-環(huán)保型脫蠟液10min-環(huán)保型脫蠟液10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2、 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。中火8min至沸，停火8min，轉(zhuǎn)中低火7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定）

3、 畫圈：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走）

4、 血清封閉:在圈內(nèi)滴加BSA孵育30min。（一抗若是山羊來源，則加驢血清）

5、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，兩種一抗按一定的稀釋比例混合，滴加到組織上，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬標(biāo)記的按一定比例配好的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。（兩種二抗，按照一定的比例混合孵育）

7、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

8、 自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后，在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

9、 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、 鏡檢拍照：切片置于掃描儀下采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光. CY5激發(fā)波長 608-648nm, 發(fā)射波長672-712。 DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，陽性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅光，綠光 。

　　同源雙標(biāo)：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2、 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。中火8min?；?min轉(zhuǎn)中低火7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定）

3、 畫圈,雙氧水封閉：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，封閉內(nèi)源性的過氧化物酶，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

4、 血清封閉: 甩干PBS, 滴加BSA，封閉30min。（一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉）

5 、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

6 、加對應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7 、加CY3-TSA（或FITC-TSA）：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

8 、微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理，中火8min停火8min轉(zhuǎn)中低火7min，去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。

9、 加第二種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

10、 加對應(yīng)的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

11、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

12、 自發(fā)熒光淬滅：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后，在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

13 、封片：切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

14 、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光.

同源雙標(biāo)技術(shù)原理介紹：

主要原理是基于酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下簡稱TSA技術(shù)。TSA是一種基于辣根過氧化物酶HRP的催化活性對靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法。技術(shù)主要原理為熒光標(biāo)記的酪胺在HRP與H2O2的作用下變?yōu)榛罨睦野?，附著在靶?biāo)周圍的蛋白酪-氨酸殘基上。此結(jié)合是共價結(jié)合，而一抗與靶標(biāo)、二抗與一抗之間是非共價結(jié)合，通過微波修復(fù)處理，第一輪的一抗二抗被洗脫，熒光標(biāo)記的酪胺依然附著在靶標(biāo)周圍。在檢測第二個靶標(biāo)時，相當(dāng)于全新的一輪標(biāo)記，無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。只需變化不同熒光標(biāo)記即可實現(xiàn)多個靶標(biāo)的標(biāo)記。通過多次重復(fù)免疫標(biāo)記，使用不同的熒光酪胺實現(xiàn)雙重或多重?zé)晒馊旧?/span>

送樣運(yùn)輸要求：

1.冰凍切片-20℃保存和運(yùn)輸。

2.石蠟切片常溫運(yùn)輸至實驗室。

3.細(xì)胞爬片PFA固定15min后用無菌PBS洗滌后用無菌PBS浸泡，4℃冰袋保存運(yùn)輸?shù)綄嶒炇?/span>