微量分型巰基測(cè)試盒

（酶標(biāo)微板法）

一、試劑的組成與配制：（24T）

試劑一：標(biāo)準(zhǔn)品粉劑，3 支，4℃密封保存 6 個(gè)月。

10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液的配制：每次測(cè)定前將 1 支標(biāo)準(zhǔn)品

粉劑加 1mL 試劑三-緩沖液溶解，即為 10mmol/L

標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，4℃密封保存。

500μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的配制：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品∶試劑

三緩沖液=1∶19 即 20 倍稀釋配成應(yīng)用液，按所

需量現(xiàn)用現(xiàn)配。

試劑二：透明劑，2mL×1 瓶，4℃密封保存 12 個(gè)月（天冷

時(shí)會(huì)凝固，每次測(cè)試前適當(dāng)水浴加溫以加速溶解，

直至透明方可應(yīng)用）。

試劑三：緩沖液，20mL×1 瓶，4℃密封保存 6 個(gè)月。

試劑四：顯色劑，3mL×1 瓶，4℃避光保存 6 個(gè)月。

工作液一的配制：按透明劑∶緩沖液∶顯色劑=1∶50∶25

的比例混合，用多少配多少。

工作液二的配制：按透明劑∶緩沖液=1∶75 的比例混合，用

多少配多少。

注：按所需檢測(cè)的樣本數(shù)加上標(biāo)準(zhǔn)孔及標(biāo)準(zhǔn)空白孔的數(shù)，

再放寬 2 孔進(jìn)行工作液的配制（避免吸到最后試劑

量不夠）。工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配，最多可保存 1～2 天。

試劑五：沉淀劑，10mL×1 瓶，室溫保存 6 個(gè)月（過飽和溶

液，如有結(jié)晶析出，直接取上清使用）。

96 孔板：一塊（本公司贈(zèng)送）。

二、操作步驟：

1、血清（漿）樣本前處理：

①、總巰基：

直接取樣進(jìn)行測(cè)定。

②、非蛋白巰基：

待測(cè)樣本：取血清（漿）50μL,加入 150μL 試劑五

沉淀劑（也可按照樣本：試劑五=1：3

比例上下調(diào)整），充分混勻 3500-4000

轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘，取上清 10μL 待測(cè)；

待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：取 500μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 50μL，加

入 150μL 試劑五沉淀劑，充分混勻后取

10μL 待測(cè)（此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度為

125μmol/L）

2、動(dòng)、植物組織、培養(yǎng)細(xì)胞前處理：

動(dòng)物組織：準(zhǔn)確稱取待測(cè)動(dòng)物組織的重量，按重量體

積比（動(dòng)物組織︰生理鹽水＝1g︰9mL），將動(dòng)物

組織剪碎后加生理鹽水用勻漿機(jī)或勻漿管制備成

10%的動(dòng)物組織勻漿，2500～3000 轉(zhuǎn)/分，離心 10

分鐘取上清（即 10%組織勻漿）待測(cè)。

植物組織：準(zhǔn)確稱取待測(cè)植物組織的重量，按重量體

積比（植物組織︰0．1mol /L pH7～7.4 磷酸鹽緩

沖液＝1g︰9mL），將植物組織剪碎后加 0.1mol/L

pH 7～7.4 磷酸鹽緩沖液用勻漿機(jī)或勻漿管制備成

10%的植物組織勻漿，3500～4000 轉(zhuǎn)/分，離心 10

分鐘取上清（即 10%組織勻漿）待測(cè)。

培養(yǎng)細(xì)胞：將細(xì)胞進(jìn)行胰-酶消化（也可將細(xì)胞直接刮

下），取出細(xì)胞及液體放入試管，1000 轉(zhuǎn)/分～3000

轉(zhuǎn)/分，離心 5 分鐘，棄上清，留沉淀細(xì)胞，再加

入 1mL 生理鹽水輕輕吹打混勻（將胰-酶及部分培

養(yǎng)液洗去），1000 轉(zhuǎn)/分～3000 轉(zhuǎn)/分，離心 5 分鐘，

棄上清，留沉淀細(xì)胞加入 0.2～0.3mL 的生理鹽水

進(jìn)行勻漿（勻漿的方法有多種：例如①

加細(xì)胞裂

解液裂解細(xì)胞；② 在冰水浴下超聲粉碎細(xì)胞；③

手動(dòng)勻漿管進(jìn)行勻漿；④ 在冰水浴下用卡富隆電

動(dòng)玻璃勻漿器電動(dòng)研磨，每次 5～10 秒，間隔 20

秒，總共研磨 3～4 次），取勻漿液待測(cè)。

①、總巰基：直接取樣進(jìn)行測(cè)定。

②、非蛋白巰基：

待測(cè)樣本：取勻漿 50μL,加入 150μL 試劑五沉淀劑

（也可按照樣本：試劑五=1：3 比例上

下調(diào)整），充分混勻，3500-4000 轉(zhuǎn)/分

離心 10 分鐘，取上清 10μL 待測(cè)；

待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：取 500μmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 50μL，加

入 150μL 試劑五沉淀劑，充分混勻后取

10μL 待測(cè)（此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度為

125μmol/L）。

四、測(cè)定原理：

5，5’-二硫代雙，2-硝基苯甲酸（DTNB）與巰基化合

物反應(yīng)時(shí)能產(chǎn)生一種黃色化合物，可進(jìn)行比色定量測(cè)定。

五、所需儀器：

單道移液器：可進(jìn)行單孔的加樣工作

多道移液器：可進(jìn)行 8 或 12 孔的加樣工作

酶標(biāo)儀，用于微量樣品比色分析，吸光度值測(cè)定

96 孔酶標(biāo)板：用于比色的孔板（本所贈(zèng)送）

六、檢測(cè)意義：

活性巰基（SH）主要存在于半胱-氨-酸，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

和生物體內(nèi)某些氧化還原反應(yīng)重要基團(tuán)。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中

2 個(gè)巰基脫氫而形成的雙硫鍵，使相鄰多肽得以連接．對(duì)

于維持蛋白質(zhì)完整結(jié)構(gòu)十分重要。所有動(dòng)物組織都含有不

同量的活性巰基，機(jī)體內(nèi)起重要作用的谷-胱-甘-肽，其生理

作用主要是靠所含半胱-氨-酸中活性巰基起還原作用。巰基

還是很多酶活性基團(tuán)，一些重金屬鹽如 Hg 2+等與酶巰基結(jié)

合，影響酶活性。巰基化合物與機(jī)體許多機(jī)能活動(dòng)，藥物

及毒物的作用以及某些疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。測(cè)

定組織和血液中巰基含量已日益為人們所重視,以期探索

對(duì)某些疾病的發(fā)生機(jī)理、治療、預(yù)防以及預(yù)后判斷等方面

的研究意義。

七、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：

取一定量的 10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用試劑三 緩沖液

配 制 成 不 同 濃 度 的 標(biāo) 準(zhǔn) 制 作 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 ： 0mmol/L 、

100μmol/L 、 200μmol/L 、 500μmol/L 、 1000μmol/L 、

2000μmol/L。

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