硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶活性測(cè)定試劑盒

（Thioredoxin peroxidase，分光光度法 100T/48 樣）

一、測(cè)定意義

TPX屬于過(guò)氧化物酶家族，在體內(nèi)主要通過(guò)還原過(guò)氧化氫和一些氫過(guò)氧化物來(lái)實(shí)現(xiàn)抗氧化作用，功能與GPX類(lèi)似，也是谷-胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。TPX普遍存在于各種生物體內(nèi)，如酵母、植物、動(dòng)物、原生動(dòng)物、寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和古細(xì)菌，在進(jìn)化上高度保守。TPX與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生調(diào)控密切相關(guān)。TPX的主要功能包括細(xì)胞脫毒、抗氧化和調(diào)節(jié)由過(guò)氧化氫介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。

二、測(cè)定原理

TPX催化H2O2氧化二硫蘇糖醇（DTT），H2O2的吸收波長(zhǎng)為240nm，通過(guò)測(cè)定240nm吸光度的下降速率，通過(guò)對(duì)照減去過(guò)氧化氫酶（CAT）催化分解的H2O2，即可計(jì)算出TPX活性。

因此，本試劑盒可以同時(shí)測(cè)定樣品TPX和CAT活性。

三、自備儀器用品

低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調(diào)節(jié)移液槍、蒸餾水

四、試劑組成和配制

試劑一 液體×1 瓶，室溫保存；

試劑二 液體×1 瓶，-20°C保存；

試劑三 液體×1 支，4°C保存。

五、粗酶液提取

1.組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.細(xì)菌、真菌： 按照細(xì)胞數(shù)量（10 4個(gè)）：試劑一體積(mL)500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎（功率300W，超聲3s，間隔7秒，總時(shí)間3min）；在4°C下1000g離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

六、TPX測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到240nm，用蒸餾水調(diào)零；

2. 試劑一和試劑二置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）預(yù)熱30min 以上；

3. CAT活性測(cè)定管：取1mL石英比色皿，加入20μL上清液，900μL試劑一，80μL試劑三，迅速混勻后與240nm測(cè)定10s和130s吸光度，分別為A1和A2，計(jì)算ΔACAT=A1-A2

4. 總活性測(cè)定管：取1mL石英比色皿，加入20μL上清液，900μL試劑二，80μL試劑三，迅速混勻后與240nm測(cè)定10s和130s吸光度，分別為A3和A4。ΔA總=A3-A4

注：對(duì)大量樣品，每個(gè)樣品都需要單獨(dú)測(cè)定其CAT活性。

七、TPX活性計(jì)算

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在37℃或25℃，每毫克蛋白每分鐘催化1μmol H2O2為1U。

CAT活性(U/mg prot) = △ACAT÷(ε×d)×V反總÷(Cpr×V樣)÷T =0.573×△ACAT÷ Cpr

總活性（U/mg prot）=△A總÷(ε×d)×V反總÷(Cpr×V樣)÷T =0.573×△A總÷ Cpr

TPX活性（U/mg prot）=總活性-CAT活性

(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：在37℃或25℃，每g組織每分鐘催化1μmol H2O2為1U。

CAT活性（U/g） △ACAT÷(ε×d)×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T =0.573×△ACAT÷W

總活性（U/g）=△A總÷(ε×d)×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T =0.573×△A總÷W

TPX活性（U/g）=總活性-CAT活性

(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

單位的定義：在37℃或25℃，每10 4個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1μmol H2O2為1U。

CAT活性（U/10 4 cells） = △ACAT÷(ε×d)×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T =0.573×△ACAT÷細(xì)胞數(shù)量

總活性（U/10 4 cells）=△A總÷(ε×d)×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T =0.573×△A總÷細(xì)胞數(shù)量

TPX活性（U/10 4 cells）=總活性-CAT活性

ε：H2O2在240nm 處摩爾吸光系數(shù)為4.36×10 4L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm；

d：比色皿光徑（cm），1cm；

V反總：反應(yīng)體系總體（L），1000μL=1×10 -3L；

Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；

V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02mL；

V樣總：加入提取液體積，1mL；

T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），2min；

W：樣本質(zhì)量，（g）；

細(xì)胞數(shù)量，（10 4）。

硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶活性測(cè)定試劑盒